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實(shí)驗(yàn)中色譜法常見(jiàn)的104個(gè)問(wèn)題

欄目:行業(yè)動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2021-01-20
色譜法總論

1.色譜分析法:

色譜法是一種分離分析方法,它利用樣品中各組分與流動(dòng)相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異),先將它們分

色譜法總論

1.色譜分析法:

色譜法是一種分離分析方法,它利用樣品中各組分與流動(dòng)相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異),先將它們分離,后按一定順序檢測(cè)各組分及其含量的方法。

2.色譜法的分離原理:

當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí),就會(huì)與柱中固定相發(fā)生作用(溶解、吸附等),由于混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異,與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同,在同一推動(dòng)力作用下,各組分在固定相中的滯留時(shí)間不同,從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分在兩相中性能上的差異,使混合物中各組分分離的技術(shù),稱(chēng)為色譜法。

3.流動(dòng)相

色譜分離過(guò)程中攜帶組分向前移動(dòng)的物質(zhì)。

4.固定相

色譜分離過(guò)程中不移動(dòng)的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。

5.色譜法的特點(diǎn):

(1)、分離效率高:復(fù)雜混合物,有機(jī)同系物、異構(gòu)體。

(2)、靈敏度高:可以檢測(cè)出μg·g-1(10-6)級(jí)甚至ng·g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。

(3)、分析速度快:一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。

(4)、應(yīng)用范圍廣:氣相色譜:沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無(wú)機(jī)試樣的分析。液相色譜:高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

(5)、高選擇性:對(duì)性質(zhì)極為相似的組分有很強(qiáng)的分離能力。不足之處:被分離組分的定性較為困難。

6.色譜分析法的分類(lèi):

按兩相狀態(tài)分類(lèi),按操作形式分類(lèi),按分離原理分類(lèi)。

7.按兩相狀態(tài)分類(lèi):

氣相色譜(GasChromatography,GC);

液相色譜(LiquidChromatography,LC);

超臨界流體色譜(SupercriticalFluidChromatography,SFC)。

氣相色譜:流動(dòng)相為氣體(稱(chēng)為載氣),常用的氣相色譜流動(dòng)相有N2、H2、He等氣體;

按分離柱不同可分為:填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜;

按固定相的不同又分為:氣固色譜和氣液色譜;

液相色譜:流動(dòng)相為液體(也稱(chēng)為淋洗液);

按固定相的不同分為:液固色譜和液液色譜;

超臨界流體色譜:

流動(dòng)相為超臨界流體,超臨界流體是一種介于氣體和液體之間的狀態(tài)。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優(yōu)勢(shì)而發(fā)展起來(lái)的一種新型的色譜分離分析技術(shù),不僅能夠分析氣相色譜不宜分析的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的試樣組分,而且具有比高效液相色譜更快的分析速率和更高的柱效率。

8.按操作形式分類(lèi):

柱色譜(ColumnChromatography,CC):固定相裝在柱管內(nèi),包括:填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。

紙色譜(PaperChromatography,PC)固定相為濾紙;

采用適當(dāng)溶劑使樣品在濾紙上展開(kāi)而進(jìn)行分離,薄層色譜(ThinLayerChromatography,TLC)

固定相壓成或涂成薄層,操作方法同紙色譜。

9.按分離原理分類(lèi):

吸附色譜(Absorptionchromatography);

分配色譜(PartitionChromatography);

離子交換色譜(IonExchangeChromatography);

凝膠色譜(GelChromatography)。

10.色譜圖:

組分在檢測(cè)器上產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間(t)所作的圖,由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況,所以,又叫色譜流出曲線(xiàn),流出曲線(xiàn)的突起部分稱(chēng)為色譜峰。

11.色譜保留值:

色譜保留值是色譜定性分析的依據(jù),它體現(xiàn)了各待測(cè)組分在色譜柱上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好,或與固定相的吸附性能越強(qiáng)的組分,在柱中的滯留時(shí)間越長(zhǎng),或者說(shuō),將組分帶出色譜柱所需的流動(dòng)相體積越大,所以,保留值可以用保留時(shí)間和保留體積兩套參數(shù)來(lái)描述。

12.色譜圖上的色譜流出曲線(xiàn)可以說(shuō)明什么問(wèn)題:

根據(jù)色譜峰的數(shù)目,可判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù);根據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析;根據(jù)色譜峰的面積或峰高進(jìn)行定量分析;根據(jù)色譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾仍u(píng)價(jià)色譜柱的分離效能;根據(jù)兩峰間的距離,可評(píng)價(jià)固定相及流動(dòng)相選擇是否合適。

13.分配比:

分配比是指,在一定溫度下,組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。

14.在色譜流出曲線(xiàn)上,兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數(shù)還是擴(kuò)散速度決定?為什么?

答:分配系數(shù)。兩峰間的距離由熱力學(xué)因素決定,兩組分在兩相中分配系數(shù)差異越大,兩峰間的距離則相差越大,越容易被分離。而擴(kuò)散速度是動(dòng)力學(xué)因素,反映在色譜流出曲線(xiàn)上即為色譜峰的區(qū)域?qū)挾?形狀)。

15.色譜理論需要解決的問(wèn)題:

色譜分離過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑,柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。

16.組分保留時(shí)間為何不同?色譜峰為何變寬?

組分保留時(shí)間:色譜過(guò)程的熱力學(xué)因素控制,(組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))。

色譜峰變寬:色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)因素控制,(兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力,擴(kuò)散作用)。

塔板理論和速率理論分別從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素。

17.半經(jīng)驗(yàn)理論:

將色譜分離過(guò)程比擬作蒸餾過(guò)程,將連續(xù)的色譜分離過(guò)程分割成多次的平衡過(guò)程的重復(fù)(類(lèi)似于蒸餾塔塔板上的平衡過(guò)程)。

18.塔板理論的特點(diǎn):

塔板理論引入了塔板數(shù)和塔板高度作為柱效的衡量指標(biāo);不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同,用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí),應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì);柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果,當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí),無(wú)論該色譜柱的塔板數(shù)多大,都無(wú)法分離。

19.塔板理論的不足:

塔板理論的基本假設(shè)不符合色譜柱的實(shí)際分離過(guò)程。塔板理論無(wú)法解釋同一色譜柱在不同的流動(dòng)相流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,不能說(shuō)明色譜峰為什么會(huì)展寬,同時(shí)未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。

20.速率方程

(也稱(chēng)范第姆特方程式):

H=A+B/u+C·u,

H:塔板高度;

u:流動(dòng)相的平均線(xiàn)速度(cm/s)。

A.─渦流擴(kuò)散項(xiàng):

A與流動(dòng)相性質(zhì)、流動(dòng)相速率無(wú)關(guān)。要減小A值,需要從提高固定相的顆粒細(xì)度和均勻性以及填充均勻性來(lái)解決。對(duì)于空心毛細(xì)管柱,A=0。固定相顆粒越小dp↓,填充的越均勻,A↓,H↓,柱效n↑,表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕,色譜峰較窄。

B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng):

存在著濃度差,產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬,H↑(n↓),分離變差;分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān),流速↓,滯留時(shí)間↑,擴(kuò)散↑;

擴(kuò)散系數(shù):

Dg∝(M載氣)-1/2;M載氣↑,B值↓。

C·u—傳質(zhì)阻力項(xiàng):

dp↓,df↓,D↑,可降低傳質(zhì)阻力。

21.H-u曲線(xiàn)與最佳流速:

由于,流速對(duì)這兩項(xiàng)完全相反的作用,流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值,即,速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對(duì)應(yīng)流速u(mài)作圖,曲線(xiàn)最低點(diǎn)的流速即為最佳流速。

22.速率理論的要點(diǎn):

組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因;通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔6?、載氣種類(lèi)、液膜厚度及載氣流速可提高柱效;速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響;各種因素相互制約,如,載氣流速增大,分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小,使柱效提高,但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大,又使柱效下降;柱溫升高,有利于傳質(zhì),但又加劇了分子擴(kuò)散的影響。選擇最佳條件,才能使柱效達(dá)到最高。

23.色譜定性方法:

①、與標(biāo)樣對(duì)照的方法:

利用保留值定性:

通過(guò)對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰,來(lái)確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。

利用加入法定性:

將純物質(zhì)加入到試樣中,觀(guān)察各組分色譜峰的相對(duì)變化。

②、利用文獻(xiàn)保留值定性:

利用相對(duì)保留值r21定性。相對(duì)保留值r21僅與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊(cè)中都列有各種物質(zhì)在不同固定相上的保留數(shù)據(jù),可以用來(lái)進(jìn)行定性鑒定。

24.色譜定量分析:

①定量校正因子:

試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比,即,mi=fi’·Ai;

絕對(duì)校正因子:

比例系數(shù)fi;

單位面積對(duì)應(yīng)的物質(zhì)量:

fI’=mi/Ai,相對(duì)校正因子fi:

即,組分的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比。

②常用的幾種定量方法:

(1)歸一化法:

特點(diǎn)及要求:

簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確;進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和操作條件的變動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大;僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。

(2)外標(biāo)法——標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法:

特點(diǎn)及要求:外標(biāo)法不使用校正因子,準(zhǔn)確性較高,操作條件變化對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。

對(duì)進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高,適用于大批量試樣的快速分析。

(3)內(nèi)標(biāo)法:

內(nèi)標(biāo)物要滿(mǎn)足以下要求:

(a)試樣中不含有該物質(zhì);

(b)與被測(cè)組分性質(zhì)比較接近;

(c)不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng);

(d)出峰位置應(yīng)位于被測(cè)組分附近,且能分離開(kāi);

(e)加入量適中并與待測(cè)組分接近。

內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn):

內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高,操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對(duì)定量結(jié)果的影響不大;

每個(gè)試樣的分析,都要進(jìn)行兩次稱(chēng)量,不適合大批量試樣的快速分析;

若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定,則:wi=Ai/As*常數(shù)。

氣相色譜法

1.氣相色譜法(GC):

是以氣體為流動(dòng)相的色譜分析法。

2.氣相色譜要求樣品:

氣化,不適用于大部分沸點(diǎn)高和熱不穩(wěn)定的化合物,對(duì)于腐蝕性能和反應(yīng)性能較強(qiáng)的物質(zhì)更難于分析。

大約有15%~20%的有機(jī)物能用氣相色譜法進(jìn)行分析。

3.氣相色譜儀的組成:

氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)。

4.氣路系統(tǒng):

包括氣源、凈化器和載氣流速控制;

常用的載氣有:氫氣、氮?dú)狻⒑狻?/p>

5.進(jìn)樣系統(tǒng):

包括:

進(jìn)樣裝置和氣化室,氣體進(jìn)樣器(六通閥):

試樣首先充滿(mǎn)定量管,切入后,載氣攜帶定量管中的試樣氣體進(jìn)入分離柱;

液體進(jìn)樣器:

不同規(guī)格的微量注射器,填充柱色譜常用10μL;毛細(xì)管色譜常用1μL;新型儀器帶有全自動(dòng)液體進(jìn)樣器,清洗、潤(rùn)沖、取樣、進(jìn)樣、換樣等過(guò)程自動(dòng)完成,一次可放置數(shù)十個(gè)試樣。

6.進(jìn)樣方式:

分流進(jìn)樣:

樣品在汽化室內(nèi)氣化,蒸氣大部分經(jīng)分流管道放空,只有極小一部分被載氣導(dǎo)入色譜柱;

不分流進(jìn)樣:

樣品直接注入色譜的汽化室,經(jīng)過(guò)揮發(fā)后全部引入色譜柱。

7.分離系統(tǒng):

色譜柱:

填充柱(2~6mm直徑,1~5m長(zhǎng)),毛細(xì)管柱(0.1~0.5mm直徑,幾十米長(zhǎng))。

8.溫控系統(tǒng)的作用:

溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù);

氣化室、色譜柱恒溫箱、檢測(cè)器三部分在色譜儀操作時(shí)均需控制溫度;

氣化室:保證液體試樣瞬間氣化;

檢測(cè)器:保證被分離后的組分通過(guò)時(shí)不在此冷凝;

色譜柱恒溫箱:準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。

9.檢測(cè)系統(tǒng):

作用:將色譜分離后的各組分的量轉(zhuǎn)變成可測(cè)量的電信號(hào);

指標(biāo):靈敏度、線(xiàn)性范圍、響應(yīng)速度、結(jié)構(gòu)、通用性,通用型——對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng);專(zhuān)屬型——對(duì)特定物質(zhì)有高靈敏響應(yīng);

檢測(cè)器類(lèi)型:

濃度型檢測(cè)器:

熱導(dǎo)檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器;

質(zhì)量型檢測(cè)器:

氫火焰離子化檢測(cè)器、火焰光度檢測(cè)器。

10.熱導(dǎo)檢測(cè)器的主要特點(diǎn):

結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性好;

對(duì)無(wú)機(jī)物和有機(jī)物都有響應(yīng),不破壞樣品;

靈敏度不高。

11.氫火焰離子化檢測(cè)器的特點(diǎn):

優(yōu)點(diǎn):

(1)、典型的質(zhì)量型檢測(cè)器;

(2)、通用型檢測(cè)器(測(cè)含C有機(jī)物);

(3)、氫焰檢測(cè)器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、響應(yīng)迅速、死體積小、線(xiàn)性范圍寬等特點(diǎn);

(4)、比熱導(dǎo)檢測(cè)器的靈敏度高出近3個(gè)數(shù)量級(jí),檢測(cè)下限可達(dá)10-12g·g-1;

缺點(diǎn):

(1)、對(duì)載氣要求高;

(2)、檢測(cè)時(shí)要破壞樣品,無(wú)法回收樣品;

(3)、不能檢測(cè)永久性氣體、水及四氯化碳等。。。

12.電子俘獲檢測(cè)器的特點(diǎn):

對(duì)鹵素、硫、磷、氮、氧有很強(qiáng)的響應(yīng);

靈敏度高,可用于痕量農(nóng)藥殘留物的分析;

線(xiàn)性范圍較窄。

13.火焰光度檢測(cè)器(FPD):

是一種對(duì)含硫、磷化合物具有高選擇性的檢測(cè)器。含硫、磷化合物在富氫火焰中燃燒被打成有機(jī)碎片,發(fā)出不同波長(zhǎng)的特征光譜。

14.固定相:

固體固定相:固體吸附劑;

液體固定相:由載體和固定液組成;聚合物固定相。

15.固體固定相:

一般為固體吸附劑,常用的有活性炭,硅膠,氧化鋁和分子篩。

優(yōu)點(diǎn):

吸附容量大、熱穩(wěn)定性好、價(jià)格便宜;

缺點(diǎn):

柱效低、吸附活性中心易中毒,使用前要進(jìn)行活化。

應(yīng)用:

主要用于惰性氣體、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一般氣體和低沸點(diǎn)物質(zhì)。

16.作為載體使用的物質(zhì)應(yīng)滿(mǎn)足的條件:

表面有微孔結(jié)構(gòu),孔徑均勻,比表面積大;

化學(xué)和物理惰性,即,與樣品組分不起化學(xué)反應(yīng),無(wú)吸附作用或吸附很弱;

熱穩(wěn)定性好;

有一定的機(jī)械強(qiáng)度和浸潤(rùn)性,不易破碎;

具有一定的粒度和規(guī)則的形狀,最好是球形。

17.對(duì)固定液的要求:

在使用溫度下是液體,具有較低的揮發(fā)性;具有良好的熱穩(wěn)定性;對(duì)要分離的各組分應(yīng)具有合適的分配系數(shù);化學(xué)穩(wěn)定性好,不與樣品組分、載氣、載體發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)。

18.固定液的分類(lèi):

非極性固定液、中等極性固定液、強(qiáng)極性固定液、氫鍵型固定液。

19.非極性固定液:

主要是一些飽和烷烴和甲基硅油,它們與待測(cè)物質(zhì)分子之間的作用力以色散力為主。組分按沸點(diǎn)由低到高順序流出,若樣品中兼有極性和非極性組分,則同沸點(diǎn)的極性組分先出峰。

常用的固定液有角鯊?fù)?異三十烷)、阿皮松等。。。適用于非極性和弱極性化合物的分析。

20.中等極性固定液:

由較大的烷基和少量的極性基團(tuán)或可以誘導(dǎo)極化的基團(tuán)組成,它們與待測(cè)物質(zhì)分子間的作用力以色散力和誘導(dǎo)力為主,組分基本上按沸點(diǎn)順序出峰,同沸點(diǎn)的非極性組分先出峰。常用的固定液有鄰苯二甲酸二壬酯、聚酯等,適用于弱極性和中等極性化合物的分析。

21.強(qiáng)極性固定液:

含有較強(qiáng)的極性基團(tuán),它們與待測(cè)物質(zhì)分子間作用力以靜電力和誘導(dǎo)力為主,組分按極性由小到大的順序出峰。常用的固定液有氧二丙腈等,適用于極性化合物的分析。

22.氫鍵型固定液:

是強(qiáng)極性固定液中特殊的一類(lèi),與待測(cè)物質(zhì)分子間作用力以氫鍵力為主,組分依形成氫鍵的難易程度出峰,不易形成氫鍵的組分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等,適用于分析含F(xiàn)、N、O等的化合物。

23.固定液的選擇:

①、按極性相似原則選擇:

極性相似,溶解度大,分配系數(shù)大,保留時(shí)間長(zhǎng);

②、按官能團(tuán)相似選擇:

酯類(lèi)——酯或聚酯類(lèi)固定液;

醇類(lèi)——聚乙二醇固定液。

③、按主要差別選擇:

各組分間沸點(diǎn)是主要差別——非極性固定液;極性為主要差別——極性固定液。

④、選擇混合固定液:

對(duì)于難分離的復(fù)雜樣品,可選用兩種或兩種以上固定液。

24.聚合物固定相:

既可作為固體固定相,也可作為載體,又稱(chēng)高分子多孔微球。物質(zhì)在其表面既存在吸附作用,又存在溶解作用。

(1)具有較大的比表面積,表面孔徑均勻;

(2)對(duì)非極性及極性物質(zhì)無(wú)有害的吸附活性,拖尾現(xiàn)象小,極性組分也能出對(duì)稱(chēng)峰;

(3)由于不存在液膜,無(wú)流失現(xiàn)象,熱穩(wěn)定性好;

(4)機(jī)械強(qiáng)度和耐腐蝕性較好,系均勻球形,在填充柱色譜中均勻性、重現(xiàn)性好,有助于減少渦流擴(kuò)散。

25.載氣種類(lèi)的選擇:

檢測(cè)器的適應(yīng)性,載氣流速的大小。

26.柱溫的選擇:

(1)首先應(yīng)使柱溫控制在固定液的最高使用溫度(超過(guò)該溫度固定液易流失)和最低使用溫度(低于此溫度固定液以固體形式存在)范圍之內(nèi)。

(2)提高柱溫,可以改善傳質(zhì)阻力,有利于提高柱效,縮短分析時(shí)間,但降低了容量因子和選擇性,不利于分離。一般的原則是:在使最難分離的組分盡可能分離的前提下,盡量采用較低的柱溫,但以保留時(shí)間適宜,峰形不拖尾為度。

(3)柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點(diǎn)時(shí)的溫度。

(4)組分復(fù)雜,沸程寬的試樣,采用程序升溫。

27.載體和固定液含量的選擇:

配比:

固定液在載體上的涂漬量,一般指的是固定液與擔(dān)體的百分比,填充柱的配比通常在5%~25%之間。

配比越低,擔(dān)體上形成的液膜越薄,傳質(zhì)阻力越小,柱效越高,分析速度也越快。配比較低時(shí),固定相的負(fù)載量低,允許的進(jìn)樣量較小。分析工作中通常傾向于使用較低的配比。

28.進(jìn)樣條件的選擇:

進(jìn)樣量應(yīng)控制在柱容量允許范圍及檢測(cè)器線(xiàn)性檢測(cè)范圍之內(nèi),進(jìn)樣要求動(dòng)作快、時(shí)間短,汽化室一般較柱溫高30~70°C。

29.提高色譜分離能力的途徑:

(1)、塔板理論:

增加柱長(zhǎng),減小柱徑,即增加柱子塔板數(shù);

(2)、速率理論:

減小組分在柱中的渦流擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力,可降低塔板高度。

30.毛細(xì)管色譜柱的結(jié)構(gòu)特點(diǎn):

(1)不裝填料阻力小,長(zhǎng)度可達(dá)百米的毛細(xì)管柱,管徑0.2mm;

(2)氣流單途徑通過(guò)柱子,消除了組分在柱中的渦流擴(kuò)散;

(3)固定液直接涂在管壁上,總柱內(nèi)壁面積較大,涂層很薄,則氣相和液相傳質(zhì)阻力大大降低。

(4)毛細(xì)管色譜柱柱效高達(dá)每米3000~4000塊理論塔板,一支長(zhǎng)度100米的毛細(xì)管柱,總的理論塔板數(shù)可達(dá)104~106。

31.毛細(xì)管色譜具有以下優(yōu)點(diǎn):

(1)分離效率高:

比填充柱高10~100倍;

(2)分析速度快:

用毛細(xì)管色譜分析比用填充柱色譜速度;

(3)色譜峰窄、峰形對(duì)稱(chēng),較多采用程序升溫方式;

(4)靈敏度高,一般采用氫焰檢測(cè)器。

(5)渦流擴(kuò)散為零。

32.毛細(xì)管色譜的類(lèi)型:

(1)涂壁毛細(xì)管柱:

將固定液直接涂敷在管內(nèi)壁上。柱制作相對(duì)簡(jiǎn)單,但柱制備的重現(xiàn)性差、壽命短。

(2)多孔層毛細(xì)管柱:

在管壁上涂敷一層多孔性吸附劑固體微粒,構(gòu)成毛細(xì)管氣固色譜。

(3)載體涂漬毛細(xì)管柱:

將非常細(xì)的擔(dān)體微粒粘接在管壁上,再涂固定液。柱效較涂壁毛細(xì)管柱高。

(4)化學(xué)鍵合或交聯(lián)毛細(xì)管柱:

將固定液通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合在管壁上或交聯(lián)在一起。使柱效和柱壽命進(jìn)一步提高。

高效液相色譜法

1.與氣相色譜相比液相色譜的優(yōu)點(diǎn):

與氣相色譜法相比,液相色譜法不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性及相對(duì)分子質(zhì)量的限制,只要求把樣品制成溶液即可,非常適合于分離生物大分子、離子型化合物,不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其他各種高分子化合物等。此外,液相色譜的流動(dòng)相不僅起到使樣品沿色譜柱移動(dòng)的作用,而且與固定相一樣,與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用,這就為控制和改善分離條件提供了一個(gè)額外的可變因素。而氣相色譜法采用的流動(dòng)相是惰性氣體,對(duì)組分沒(méi)有親和力,僅起運(yùn)載作用。

2.液相色譜特點(diǎn):

高壓、高速、高效、高靈敏度、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。

3.高效液相相色譜儀的組成:

高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

4.流動(dòng)相使用前必須脫氣:

常用的脫氣方法有:

低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空,可同時(shí)加熱或向溶劑吹氮?dú)?、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。

5.梯度洗脫:

用兩種(或多種)不同極性的溶劑,在分離過(guò)程中按一定程序連續(xù)改變流動(dòng)相中溶劑的配比和極性,通過(guò)流動(dòng)相中極性的變化來(lái)改變被分離組分的分離因素,以提高分離效果。

6.高壓梯度(內(nèi)梯度):

特點(diǎn)是先加壓后混合,將溶劑用高壓泵增壓以后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室,加以混合后送入色譜柱。

低壓梯度(外梯度):特點(diǎn)是先混合后加壓。在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷V柱。

7.進(jìn)樣系統(tǒng)要求:

良好的密封性,最小的死體積,最好的穩(wěn)定性,進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)壓力、流量影響較小。

8.分離系統(tǒng):

色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管。一般色譜柱長(zhǎng)5~30cm,內(nèi)徑4~5mm,凝膠色譜柱內(nèi)徑3~12mm,而制備色譜柱內(nèi)徑則可達(dá)25mm。一般淋洗溶劑在進(jìn)入色譜分離柱之前,先通過(guò)前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為3~10m,填充常采用勻漿法,色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

9.檢測(cè)系統(tǒng):

作用——用來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見(jiàn)吸收檢測(cè)器、光電二極管陣列檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器。

10.高效液相色譜法對(duì)流動(dòng)相的要求:

流動(dòng)相不與色譜柱發(fā)生不可逆化學(xué)變化,以保持柱效或柱子的保留性質(zhì)較長(zhǎng)時(shí)間不變;對(duì)待測(cè)樣品有足夠的溶解能力;與所用檢測(cè)器相匹配;粘度盡可能小,以獲得較高的柱效;流動(dòng)相純度要高,價(jià)格便宜,毒性小。

11.高效液相色譜法的固定相的分類(lèi):

(1)按固定相承受壓力分:

剛性固體:

以二氧化硅為基質(zhì),可承受較高壓力,表面可鍵合各種功能官能團(tuán)——鍵合固定相,是目前應(yīng)用最廣泛的固定相。

硬膠:

主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中,由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成,可承受的壓力較低。

(2)按孔隙深度分:

表面多孔型:基體是球形玻璃珠,在玻璃表面涂覆一層多孔活性物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹(shù)脂、分子篩等。

優(yōu)點(diǎn):適用于快速分離、填充均勻緊密、機(jī)械強(qiáng)度高、能承受高壓,適于簡(jiǎn)單的樣品及常規(guī)分析;

缺點(diǎn):多孔層薄,進(jìn)樣量受限制;

全多孔型:由硅膠顆粒聚集而成,比表面積大,柱容量大,小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質(zhì)速率快,柱效高,分離效果好,適合于復(fù)雜樣品、痕量組分的分離分析,是目前HPLC中應(yīng)用最廣泛的固定相。

12.液固吸附色譜法原理:

是以固體吸附劑為固定相,吸附劑表面的活性中心具有吸附能力,試樣分子被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)時(shí),它將與流動(dòng)相溶劑分子在吸附劑表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附。分離過(guò)程是一個(gè)吸附-解吸的平衡過(guò)程。

13.液固吸附色譜法固定相:

通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑,硅膠最常用;

流動(dòng)相:極性大的試樣需用極性強(qiáng)的洗脫劑,極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。

應(yīng)用:幾何異構(gòu)體分離和族分離,如農(nóng)藥異構(gòu)體;石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強(qiáng)極性的離子型樣品的分離,不適于分離同系物(因?yàn)椋鼘?duì)相對(duì)分子質(zhì)量的選擇性較小)。

14.液液分配色譜法原理:

根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同實(shí)現(xiàn)分離,分配系數(shù)較大的組分保留值也較大。

15.液液分配色譜法流動(dòng)相:

流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶,或者二者的極性相差越大越好。根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度,可將液液色譜分為正相分配色譜(流動(dòng)相極性小于固定相極性,極性小的先流出,適于強(qiáng)極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動(dòng)相極性大于固定相極性,極性大的先流出,適于非極性或弱極性組分分離)。

固定相:由載體和固定液組成。常用的固定液有b,b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鯊?fù)榈取?/p>

應(yīng)用:同系物組分的分離。

例:分離水解蛋白質(zhì)所生成的各種氨基酸,分離脂肪酸同系物等。

16.化學(xué)鍵合固定相:

化學(xué)鍵合固定相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上,形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。

17.化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn):

固定相不易流失,柱的穩(wěn)定性和壽命較高;能耐受各種溶劑,可用于梯度洗脫;表面較為均一。沒(méi)有液坑,傳質(zhì)快,柱效高;能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性。例如,鍵合氰基、氨基等極性集團(tuán)用于正相色譜法,鍵合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法,鍵合C2、C4、C6、C8、C18、C16、C18、C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)用于反相色譜法等。因此,它是HPLC較為理想的固定相。

18.離子交換色譜法原理:

離子交換色譜法的固定相是離子交換樹(shù)脂,流動(dòng)相是水溶液,它是利用待測(cè)樣品中各組分離子與離子交換樹(shù)脂的親和力的不同而進(jìn)行分離的。

19.離子交換色譜法流動(dòng)相:

水的緩沖溶液,陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相,采用酸性水溶液;陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相,采用堿性水溶液;

應(yīng)用:離子及可離解的化合物,氨基酸、核酸等。

20.凝膠色譜法原理:

凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類(lèi)物質(zhì),流動(dòng)相為水溶液或有機(jī)溶劑,它是根據(jù)不同組分分子體積的大小進(jìn)行分離的。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙,由其中通過(guò),出峰最慢;中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙,中速通過(guò);而大分子被排斥在外,出峰最快;溶劑分子小,故在最后出峰。全部在死體積前出峰;可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100~105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。

21.凝膠色譜法流動(dòng)相:

能溶解樣品且與凝膠相似(潤(rùn)濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴(kuò)散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。

22.影響分離的因素與提高柱效的途徑:

(1)液體的黏度比氣體大一百倍,密度為氣體的一千倍左右,故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。

(2)由速率方程,降低固定相粒度可提高柱效。

(3)液相色譜中,不可能通過(guò)增加柱溫來(lái)改善傳質(zhì)。

(4)恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。

(5)流速大于0.5cm/s時(shí),H~u曲線(xiàn)是一段斜率不大的直線(xiàn)。降低流速,柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中,流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。(6)氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜,其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中,分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作,一般很少自行制備。

質(zhì)譜分析法

1.質(zhì)譜法定義:

是將待測(cè)物質(zhì)置于離子源中電離形成帶電離子,讓離子加速并通過(guò)磁場(chǎng)或電場(chǎng)后,離子將按質(zhì)荷比(m/z)大小分離,形成質(zhì)譜圖。依據(jù)質(zhì)譜線(xiàn)的位置和質(zhì)譜線(xiàn)的相對(duì)強(qiáng)度建立的分析方法稱(chēng)為質(zhì)譜法。

2.質(zhì)譜的作用:

準(zhǔn)確測(cè)定物質(zhì)的分子量;

質(zhì)譜法是唯一可以確定分子式的方法;

根據(jù)碎片特征進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)分析。

3.質(zhì)譜分析的基本原理:

質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)原理,將待測(cè)樣品分子解離成具有不同質(zhì)量的離子,然后按其質(zhì)荷比(m/z)的大小依次排列收集成質(zhì)譜。根據(jù)質(zhì)譜中的分子離子峰(M+)可以獲得樣品分子的相對(duì)分子質(zhì)量信息;根據(jù)各離子峰(分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰等)及其相對(duì)強(qiáng)度和氮數(shù)規(guī)則,可以確定化合物的分子式;根據(jù)各離子峰及物質(zhì)化學(xué)鍵的斷裂規(guī)律可以進(jìn)行定性分析和結(jié)構(gòu)分析;根據(jù)組分質(zhì)譜峰的峰高與濃度間的線(xiàn)性關(guān)系可以進(jìn)行定量分析。

4.質(zhì)譜分析的過(guò)程:

1.進(jìn)樣,化合物通過(guò)汽化引入電離室;

2.離子化,在電離室,組分分子被一束加速電子碰撞,撞擊使分子電離形成正離子;

3.離子也可因撞擊強(qiáng)烈而形成碎片離子;

4.荷正電離子被加速電壓V加速,產(chǎn)生一定的速度v,與質(zhì)量、電荷及加速電壓有關(guān);

5.加速正離子進(jìn)入一個(gè)強(qiáng)度為B的磁場(chǎng)(質(zhì)量分析器),發(fā)生偏轉(zhuǎn)。

5.質(zhì)譜儀的組成:

真空系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源或電離室、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器。

6.真空系統(tǒng)作用:

是減少離子碰撞損失,若真空度低:大量氧會(huì)燒壞離子源的燈絲;會(huì)使本底增高,干擾質(zhì)譜圖;引起額外的離子-分子反應(yīng),改變裂解模型,使質(zhì)譜解釋復(fù)雜化;干擾離子源中電子束的正常調(diào)節(jié);用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起放電等。

7.進(jìn)樣系統(tǒng)目的:

高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低;間歇式進(jìn)樣系統(tǒng)——?dú)怏w及低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的液體;直接探針進(jìn)樣——高沸點(diǎn)的液體、固體;色譜進(jìn)樣系統(tǒng)——有機(jī)化合物。

8.離子源或電離室:

作用是使試樣中的原子、分子電離成離子,其性能影響質(zhì)譜儀的靈敏度和分辨率本領(lǐng)。

電子電離源的特點(diǎn):

電離電壓:

70eV;加一小磁場(chǎng)增加電離幾率;EI源電離效率高,碎片離子多,結(jié)構(gòu)信息豐富,有標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜庫(kù);結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,操作方便;樣品在氣態(tài)下電離,不能汽化的樣品不能分析,主要用于氣-質(zhì)聯(lián)用儀;有些樣品得不到分子離子。

9.化學(xué)電離源特點(diǎn):

電離能小,質(zhì)譜峰數(shù)少,譜圖簡(jiǎn)單;最強(qiáng)峰為(M+1)+準(zhǔn)分子離子峰;不適用難揮發(fā)試樣。

10.快原子轟擊源:

高能量的Xe原子轟擊涂在靶上的樣品,濺射出離子流。本法適合于高極性、大分子量、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性差的樣品,F(xiàn)AB一般用作磁式質(zhì)譜的離子源。

11.電噴霧源結(jié)構(gòu):

噴嘴(金屬毛細(xì)管),霧化氣,干燥氣。

原理:

噴霧蒸發(fā)電壓。

特點(diǎn):

ESI是最軟的一種電離方式,只產(chǎn)生分子離子,不產(chǎn)生碎片離子;適用于強(qiáng)極性,大分子量的樣品分析,如,肽,蛋白質(zhì),糖等;產(chǎn)生的離子帶有多電荷,尤其是生物大分子;主要用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,既用作液相色譜和質(zhì)譜儀之間的接口裝置,同時(shí)又是電離裝置。

12.場(chǎng)致電離源(FI)和場(chǎng)解吸電離源(FD):

分子離子峰強(qiáng);碎片離子峰少;不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

13.基質(zhì)輔助激光解吸電離特點(diǎn):

準(zhǔn)分子離子峰很強(qiáng)且碎片離子少。通常用于飛行時(shí)間質(zhì)譜,特別適合測(cè)定多肽、蛋白質(zhì)、DNA片段、多糖等的相對(duì)分子質(zhì)量。

14.質(zhì)量分析器作用:

將離子源產(chǎn)生的離子按質(zhì)荷比m/z的大小分開(kāi)。

15.單聚焦分析器:

離子的m/z與R,B,V有關(guān)。通過(guò)改變磁場(chǎng)可以把不同離子分開(kāi)。在一定磁感應(yīng)強(qiáng)度B下,改變加速電壓V可以使不同離子先后通過(guò)檢測(cè)器,實(shí)現(xiàn)質(zhì)量掃描,得到質(zhì)譜。特點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,操作方便;只有方向聚焦,無(wú)能量聚焦,分辨率低。

16.雙聚焦分析器:

實(shí)現(xiàn)方向聚焦和能量(速度)聚焦;

對(duì)于動(dòng)能不同的離子,通過(guò)調(diào)節(jié)電場(chǎng)能,達(dá)到聚焦的目的。

特點(diǎn):分辨率高。

17.四級(jí)桿質(zhì)量分析器:

特點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,體積小、重量輕,掃描速率快,適合與色譜聯(lián)機(jī)。

18.飛行時(shí)間質(zhì)量分析器:

特點(diǎn):質(zhì)量范圍寬,掃描速率快,既不需磁場(chǎng)也不需電場(chǎng),只需要直線(xiàn)漂移空間。

19.離子阱質(zhì)量分析器:

特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn),改變端電極電壓,不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測(cè)器。

特點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于操作、靈敏度高。

20.質(zhì)譜的表示方法:

質(zhì)譜一般可用線(xiàn)譜或表譜兩種方法表示,常用線(xiàn)譜;線(xiàn)譜上的各條直線(xiàn)表示一個(gè)離子峰,橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m/z,縱坐標(biāo)為離子的相對(duì)強(qiáng)度(相對(duì)豐度),一般將原始質(zhì)譜圖上最強(qiáng)的離子峰定為基峰并定為相對(duì)強(qiáng)度100%,其他離子峰以對(duì)基峰的相對(duì)百分值表示。能夠很直觀(guān)地觀(guān)察到整個(gè)分子的質(zhì)譜全貌;質(zhì)譜表是用表格形式表示的質(zhì)譜數(shù)據(jù),質(zhì)譜表中有兩項(xiàng)即質(zhì)荷比及相對(duì)強(qiáng)度,對(duì)定量計(jì)算較直觀(guān)。

21.質(zhì)譜儀的分辨率:

分辨率(R)指質(zhì)譜儀能區(qū)別鄰近兩個(gè)質(zhì)譜峰的能力,對(duì)兩個(gè)相等強(qiáng)度的相鄰峰,當(dāng)兩峰間的峰谷不大于其峰高10%時(shí),則認(rèn)為兩峰已經(jīng)分開(kāi)。

22.質(zhì)譜圖中主要離子峰的類(lèi)型:

分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰。

23.相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定:

分子離子峰的m/z相當(dāng)于該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量。

一般除同位素離子峰外,分子離子峰是質(zhì)譜圖中最大質(zhì)荷比的峰,位于質(zhì)譜圖的最右端。

24.確認(rèn)分子離子峰的方法:

(1)分子離子峰必須符合氮數(shù)規(guī)則:

有機(jī)化合物含有偶數(shù)個(gè)氮原子或不含氮原子,分子離子峰的m/z一定是偶數(shù);含奇數(shù)個(gè)氮原子,分子離子峰的m/z一定是奇數(shù);

(2)分子離子峰與相鄰離子峰的質(zhì)量差應(yīng)合理,如,不可能出現(xiàn)比分子離子峰質(zhì)量小4~13個(gè)質(zhì)量單位的峰;

(3)當(dāng)化合物中含S,Br,Cl時(shí),可利用M+(M2+)+等同位素離子峰的比例來(lái)確認(rèn)分子離子峰。

(4)改變質(zhì)譜儀的操作條件,提高分子離子峰的相對(duì)強(qiáng)度。

※采用化學(xué)電離源或降低電子轟擊源電壓可獲得較強(qiáng)的M+峰。

25.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:

質(zhì)譜:純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

色譜:化合物分離,定性能力差。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用:共同優(yōu)點(diǎn),GC-MS、LC-MS、CE-MS,色譜是質(zhì)譜的進(jìn)樣及分離系統(tǒng),質(zhì)譜是色譜的檢測(cè)器。

主要問(wèn)題:接口技術(shù),除去色譜中大量的流動(dòng)相分子。

適用范圍:適用于揮發(fā)度低、難氣化、極性強(qiáng)、相對(duì)分子質(zhì)量大及熱穩(wěn)定性差的樣品。

26.無(wú)損檢測(cè)定義:

無(wú)損檢測(cè)技術(shù)即非破壞性檢測(cè),就是在不破壞待測(cè)物質(zhì)原來(lái)的狀態(tài)、化學(xué)性質(zhì)等前提下,為獲取與待測(cè)物的品質(zhì)有關(guān)的內(nèi)容、性質(zhì)或成分等物理、化學(xué)情報(bào)所采用的檢查方法。


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